Биоразнообразие во дворах детских садов усиливает иммунорегуляцию у детей
Текст ниже является переводом исследования Biodiversity intervention enhances immune regulation and health-associated commensal microbiota among daycare children, 2020 («Вмешательство, направленное на повышение биоразнообразия, усиливает иммунорегуляцию и связанную со здоровьем комменсальную микробиоту у детей детских садов»). Исследование было опубликованно в журнале Science Advances, издаваемом American Association for the Advancement of Science. Материал распространяется по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY 4.0), что допускает его перевод и распространение при указании авторства. Перевод выполнен в ознакомительных целях и не включает элементы оригинальной публикации, такие как форматирование, иллюстрации, гиперссылки и список литературы. Рекомендуем обращаться к оригинальной версии статьи для уточнений, цитирования и научного использования. Оригинальная статья прикреплена выше в формате файла pdf.
Поскольку заболеваемость иммуноопосредованными болезнями быстро растет в развитых обществах, существует неудовлетворенная потребность в новых профилактических подходах для борьбы с этими недугами.
Данное исследование является первым интервенционным испытанием на людях, в котором биоразнообразие городской среды было изменено с целью изучения его влияния на комменсальный микробиом и иммунорегуляцию у детей.
Мы проанализировали изменения микробиоты кожи и кишечника, а также иммунных маркеров крови у детей в течение 28-дневного вмешательства, направленного на повышение биоразнообразия. Для сравнения были проанализированы дети из обычных городских и природоориентированных детских садов. Вмешательство повысило разнообразие как окружающих, так и кожных сообществ Gammaproteobacteria, что, в свою очередь, было связано с увеличением уровней TGF-β1 в плазме и доли регуляторных Т-клеток. Отношение IL-10 к IL-17A в плазме увеличилось у детей из группы вмешательства в ходе испытания.
Наши результаты позволяют предположить, что вмешательство, направленное на повышение биоразнообразия, усиливает иммунорегуляторные пути и дает стимул для будущих профилактических подходов к снижению риска иммуноопосредованных заболеваний в городских обществах.
Наблюдательные исследования показали, что иммуноопосредованные заболевания встречаются чаще среди населения, ведущего современный городской образ жизни, чем среди населения с доиндустриальным образом жизни (1–3). Одна из ведущих гипотез утверждает, что основной причиной такой картины является очевидная потеря биоразнообразия в современных условиях жизни (3–6). Однако убедительные доказательства, основанные на интервенционных испытаниях на людях, все еще отсутствуют.
Потеря биоразнообразия в городских районах ограничивает воздействие разнообразной микробиоты, но увеличивает воздействие патогенных бактерий в плотно застроенных районах (5). Высокий уровень гигиены и западный городской образ жизни (например, потребление переработанных продуктов и использование антибиотиков) также влияют на комменсальную микробиоту человека (7, 8). Кроме того, городские загрязнители изменяют микробные сообщества, связанные со здоровьем человека и иммуноопосредованными заболеваниями (9–11).
Все эти факторы могут привести к микробному дисбалансу, называемому дисбиозом, который связывают с иммуноопосредованными заболеваниями (4, 12, 13). К детерминантам раннего возраста, влияющим на микробиоту кишечника, относятся способ рождения, генетика, использование антибиотиков, диета и другие факторы окружающей среды (14). В то время как микробиота кишечника годовалых детей доминирует Faecalibacterium, Bacteroides и Anaerostipes (15), здоровая микробиота кишечника взрослых характеризуется типами Bacteroidetes и Firmicutes, особенно родами Bacteroides и Prevotella (16, 17). Lactobacillales является доминирующим порядком на коже годовалых детей, а разнообразие кожной микробиоты увеличивается с возрастом (18). Основные причины, по которым кожная микробиота меняется с возрастом, связаны с физиологией человека и усилением влияния внешних факторов, таких как домашние животные и среда обитания (18).
Доминирующими таксонами бактерий на коже здоровых взрослых являются типы Actinobacteria, Firmicutes и Proteobacteria, особенно роды Propionibacterium, Staphylococcus и Corynebacterium (16, 19). Actinobacteria и Proteobacteria также являются доминирующими типами в почве (5, 6, 10, 11). Хотя кожные и почвенные бактериальные сообщества имеют несколько общих таксонов (4, 19, 20), таксономический состав заметно различается между почвенными и кишечными сообществами (5, 17, 21).
Несмотря на это таксономическое различие, последние данные указывают на то, что тип почвенного покрова и садовая растительность вокруг постоянного места жительства влияют на микрофлору кишечника (17). Предполагается, что воздействие микробов окружающей среды, комменсальная микробиота человека и иммунологические пути взаимосвязаны (4, 8, 14, 17). Уровни цитокинов в плазме и частоты FOXP3+ регуляторных Т-клеток (Treg) в крови могут использоваться в качестве суррогатных маркеров изменений в иммунорегуляторных путях. Интерлейкин-10 (IL-10) является противовоспалительным цитокином, и его уровни в крови отражают активацию иммунорегуляторных путей (22).
Трансформирующий фактор роста–β1 (TGF-β1) является многофункциональным цитокином, который подавляет воспалительные процессы, особенно в иммунной системе, ассоциированной с кишечником (22). IL-17 является провоспалительным цитокином, который связан с несколькими иммуноопосредованными заболеваниями, включая диабет 1 типа (23), воспалительные заболевания кишечника, ревматоидный артрит и рассеянный склероз (24). Treg-клетки являются важнейшими регуляторами иммунной системы, играющими ключевую роль в поддержании самотолерантности, а также толерантности к комменсальной микробиоте, тем самым предотвращая аутоиммунные и хронические воспалительные заболевания (25).
Поскольку иммуноопосредованные заболевания являются новой проблемой здоровья в урбанизированных обществах, существует неудовлетворенная потребность в новых профилактических подходах для борьбы с этими недугами. Чтобы решить эту задачу, мы провели интервенционное исследование для проверки гипотезы биоразнообразия (3).
В этом исследовании экологическое биоразнообразие городских детских садов было обогащено путем покрытия их дворов лесной подстилкой и дерном. Эффект вмешательства изучался среди 75 городских детей в возрасте от 3 до 5 лет, посещающих три разных типа детских садов: (i) обычные дворы, (ii) дворы с элементами биоразнообразия (группа вмешательства) и (iii) природоориентированные детские сады, где дети ежедневно посещали близлежащие леса. Мы измерили микробиоту кожи и кишечника, уровни цитокинов в плазме и частоту Treg-клеток в крови у этих детей до и после 28-дневного периода вмешательства. Кроме того, мы сравнили микробиоту окружающей среды между обычными дворами и дворами с вмешательством. Основываясь на более ранних сравнительных исследованиях среди детей (1, 4), мы выдвинули гипотезу, что вмешательство, направленное на повышение биоразнообразия, повлияет на комменсальную микробиоту детей и что положительное изменение в разнообразии кожной микробиоты будет связано с усиленной секрецией иммунорегуляторных цитокинов и/или увеличением количества Treg-клеток после испытания. Кроме того, мы ожидали, что изменения в комменсальной микробиоте будут отражать состав микробиоты окружающей среды в группе вмешательства, а связи между комменсальной микробиотой и иммунным ответом будут отличаться в этой группе по сравнению с группой стандартного детского сада.
Вмешательство изменило микробиоту поверхностного слоя почвы во дворах детских садов. В исследование были включены десять детских садов в двух городах Финляндии (Лахти и Тампере), каждый с населением более 100 000 жителей (Таблица 1). Три из них были природоориентированными детскими садами, которые служили положительным контролем (испытуемые, n = 23). Каждый из стандартных городских детских садов содержал дворы площадью примерно 500 м² с небольшим количеством зелени или без нее. В четырех из этих дворов детских садов, далее называемых «детские сады с вмешательством», мы заменили часть гравия лесной подстилкой (100 м²) и дерном (200 м²) (испытуемые, n = 36). Три неизмененных двора («стандартные детские сады») служили контролем (испытуемые, n = 16). Детские сады с вмешательством получили фрагменты лесной подстилки, дерна, кашпо для выращивания однолетних растений и торфяные блоки для лазания и копания.
Растительность на перенесенной естественной лесной подстилке состояла в основном из вереска обыкновенного (Calluna vulgaris), черники (Vaccinium sp.), водяники (Empetrum nigrum) и мхов (Pleurozium shreberi, Hylocomium splendens, Sphagnum sp. и Dicranum sp.). Дерн состоял из овсяниц (Festuca sp.) и мятликов (Poa sp.). Воспитатели детских садов направляли детей на контакт с привнесенными зелеными материалами. К направленным мероприятиям относились, например, посадка растений в ящики, поделки из природных материалов и игры. Кроме того, зеленые материалы были доступны детям во время свободных занятий на улице (26).
Дети играли во дворах примерно от 0,5 до 2 часов два раза в день в детских садах с вмешательством и стандартных детских садах (26). Среднее время пребывания на улице составляло 1,5 часа. Детям ежедневно подавали три одинаковых приема пищи (завтрак, обед и полдник) в участвующих детских садах; две центральные кухни, по одной в каждом городе, готовили еду в соответствии с подробными рекомендациями для детей раннего возраста, опубликованными Национальным советом по питанию Финского продовольственного управления (www.ruokavirasto.fi/en/themes/healthy-diet/national-nutrition-council/).
Личное потребление свежих растений, количество контактов с животными, время, проведенное на улице или на природе, и количество братьев и сестер были одинаковыми во всех группах детских садов (таблица S1). Вмешательство длилось 28 дней в мае–июне 2016 года.
Чтобы измерить различия в микробном сообществе окружающей среды между измененными и неизмененными дворами детских садов и оценить, были ли таксономические изменения аналогичны изменениям в бактериальных сообществах кожи, мы сравнили состав сообщества, относительную численность, богатство и разнообразие бактериальных сообществ в образцах поверхностного слоя почвы. Мы отобрали образцы поверхностного слоя почвы со дворов детских садов с вмешательством и стандартных детских садов после 28-дневного периода вмешательства (образцы были собраны из песочницы и игровой площадки, рядом с качелями, спортивным комплексом и главной дверью). Те же поверхностные почвы (песочница и игровая площадка) были отобраны также в день 0, до прибытия материалов для вмешательства.
В образцах поверхностного слоя почвы относительная численность Proteobacteria (36% до и 34% после вмешательства), Bacteroidetes (24 и 28%), Actinobacteria (20 и 15%) и Acidobacteria (5 и 7%) превышала 5%. После вмешательства состав сообществ этих типов и всего бактериального сообщества различался между дворами детских садов с вмешательством и стандартными детскими садами (таблица S2A и рис. S1A). Вмешательство изменило состав сообщества Gammaproteobacteria в поверхностных почвах [данные по численности в таблице S2B: PERMANOVA, P = 0,008 и Padj = 0,03; рис. S1B], и это сообщество отличалось между дворами с вмешательством и стандартными дворами после вмешательства (данные по наличию/отсутствию в таблице S2A: PERMANOVA, P = 0,03 и Padj = 0,05; рис. S1B). Более того, неклассифицированные OTU Gammaproteobacteria были обогащены во дворах детских садов с вмешательством, и их относительная численность была более чем в восемь раз выше по сравнению со стандартными дворами детских садов после периода вмешательства (таблица S3, A и B). Наблюдаемое богатство OTU и разнообразие Шеннона всего бактериального сообщества (Padj = 0,04 в обоих случаях) и богатство Gammaproteobacteria были выше в дворах с вмешательством, чем в стандартных дворах (рис. 1, A и B, и таблица S3C). Мы использовали многомерную однородность групповых дисперсий [PERMDISP] для изучения бета-разнообразия, и она показала, что бета-разнообразие пяти родов было выше в детских садах с вмешательством, чем в стандартных детских садах (таблица S2C).
После испытания (A) сообщество Gammaproteobacteria и (B) общее бактериальное сообщество поверхностного слоя почвы было более разнообразным в почвах дворов детских садов с вмешательством по сравнению со стандартными дворами детских садов. На коже альфа-разнообразие (индекс Шеннона) © Proteobacteria было выше среди детей в детских садах с вмешательством (n = 29) и природоориентированных детских садах (n = 19) по сравнению с детьми в стандартных детских садах (n = 13) после периода исследования. (D) Разнообразие Alphaproteobacteria на коже детей детских садов с вмешательством увеличилось в ходе вмешательства и было выше по сравнению с детьми в стандартных детских садах после периода исследования. (E) Разнообразие Betaproteobacteria было выше среди детей в природоориентированных детских садах и (F) разнообразие Gammaproteobacteria выше среди детей в детских садах с вмешательством по сравнению с детьми в стандартных детских садах после периода исследования. Данные представлены как средние значения ± SE. *P < 0,05 и **P < 0,01, t-тесты после вмешательства (A и B), пост-хок тесты Данна после вмешательства (C–E) и критерий знаковых рангов Уилкоксона (D).
В соответствии с предыдущими исследованиями (4, 12), вмешательство, направленное на повышение биоразнообразия, было связано с высоким разнообразием кожных Proteobacteria. Мы сравнили индексы разнообразия Шеннона кожных бактерий между тремя различными группами детских садов с помощью ковариационного анализа (ANCOVA) и с помощью критериев Крускала-Уоллиса и пост-хок тестов Данна с использованием пола в качестве ковариаты. До вмешательства у детей в природоориентированных детских садах состав бактериального сообщества на коже отличался от такового у детей в стандартных детских садах (таблица S2D и рис. S1C), а кожное сообщество Alphaproteobacteria было более разнообразным по сравнению с детьми в детских садах с вмешательством (рис. 1D и таблица S4). Группы стандартных детских садов и детских садов с вмешательством имели сходный состав бактериального сообщества (таблица S2D) и обладали одинаково разнообразными кожными сообществами Proteobacteria, включая классы Alpha-, Beta- и Gammaproteobacteria до периода вмешательства (рис. 1, C–F, и таблица S4).
После испытания у детей в детских садах с вмешательством были более разнообразные кожные сообщества Proteobacteria и Gammaproteobacteria, чем у детей в стандартных детских садах (рис. 1, C–F, и таблица S4). Сравнения «до-после» с использованием парных t-тестов и статистики Уилкоксона выявили одно различие: разнообразие Alphaproteobacteria увеличилось в детских садах с вмешательством (рис. 1D и таблица S5), став выше по сравнению с детьми в стандартных детских садах (рис. 1D и таблица S4). Эти результаты демонстрируют, как вмешательство, направленное на повышение биоразнообразия, способствовало или предотвращало потерю разнообразия кожных бактерий в течение периода исследования, приводя к разнообразию, сопоставимому с таковым в природоориентированных детских садах (рис. 1).
Поскольку известно, что пробиотики и лекарства, такие как антибиотики, влияют на микробное сообщество кишечника (14, 27), мы исключили из анализов микробиома кишечника тех испытуемых, которые получали пробиотики или лекарства во время вмешательства (Таблица 1). Мы наблюдали несколько различий, связанных со средой детского сада. У детей в детских садах с вмешательством относительная численность Clostridiales снизилась (P = 0,003 и Padj = 0,04), а альфа-разнообразие Ruminococcaceae (P = 0,01 и Padj = 0,05), известного содержанием видов, продуцирующих бутират, увеличилось (таблица S6A; парные t-тесты). Никаких таких изменений не наблюдалось у детей в природоориентированных или стандартных детских садах (таблица S6, B и C). Дополнительно мы сравнили различия в составе сообщества кишечных бактерий между тремя группами детских садов с помощью PERMANOVA. У детей в стандартных и природоориентированных детских садах был различающийся состав сообщества Ruminococcaceae как до (P = 0,05 и Padj = 0,10), так и после (P = 0,01 и Padj = 0,03) периода вмешательства, в то время как у детей стандартных детских садов и детских садов с вмешательством были схожие сообщества Ruminococcaceae в начале вмешательства (P = 0,14), но слегка различающиеся сообщества в конце вмешательства (P = 0,03 и Padj = 0,08; таблица S2E и рис. S1, E и F). Более того, таксоны Faecalibacterium различались по PERMANOVA между детьми из природоориентированных и стандартных детских садов после вмешательства (P = 0,03; таблица S2F).
Мы проанализировали уровни цитокинов IL-10, IL-17A и TGF-β1 в образцах плазмы и частоту CD4+CD25+CD127lowFOXP3+ Treg-клеток в образцах крови с помощью проточной цитометрии. Мы искали связи между изменениями уровней цитокинов в плазме или общих частот Treg-клеток и изменениями в разнообразии и численности бактерий с помощью линейных моделей смешанных эффектов (LMM) и неметрического многомерного шкалирования (NMDS). Кроме того, мы провели сравнение «до-после» уровней цитокинов и их соотношений. Эти сравнения показали, что соотношение IL-10:IL-17A увеличилось среди детей группы вмешательства, но не среди детей в стандартных или природоориентированных детских садах (Таблица 2).
Когда все дети были проанализированы вместе в LMM, увеличение разнообразия кожных Gammaproteobacteria было связано с увеличением концентрации TGF-β1 в плазме (Padj = 0,01; рис. 2A и таблица S7A), а среди детей группы вмешательства это увеличение разнообразия также было связано со снижением уровня IL-17A в плазме (Padj = 0,002; рис. 2B и таблица S7B) и увеличением процентной доли Treg-клеток (P = 0,016; рис. 2 °C и таблица S7C). Среди детей природоориентированных детских садов высокое разнообразие Gammaproteobacteria в кожных микробиомах было связано с увеличением концентрации IL-10 в плазме (Padj = 2,3 × 10⁻⁶; таблица S7D), тогда как среди детей стандартных детских садов низкое разнообразие Gammaproteobacteria было связано со снижением экспрессии TGF-β1 (Padj = 0,01; таблица S7E и рис. S2).
Когда все дети были проанализированы вместе в модели NMDS, состав сообщества видов Faecalibacterium в кишечнике был связан с концентрацией IL-17A в плазме после периода вмешательства (P = 0,015 и Padj = 0,045; таблица S8). Среди детей из природоориентированных детских садов более высокая численность Faecalibacterium Otu00007 (Faecalibacterium prausnitzii в BLASTN; покрытие запроса = 100%, E значение = 2 × 10⁻¹²⁷, идентичность = 99%) была связана с более низкими уровнями IL-17A в плазме (LMM, Padj = 0,004), тогда как более высокая численность Faecalibacterium Otu000008 (совпадений в BLASTN с порогом значимости 10 не найдено) была связана с более высокими уровнями IL-17A в плазме (LMM, Padj = 0,009; рис. 2D и таблица S7F). Последняя связь была слабее, но также значима среди детей в стандартных детских садах (LMM, Padj = 0,04; таблица S7G). Среди детей природоориентированных детских садов снижение концентрации IL-17A в плазме дополнительно было связано со снижением относительной численности Romboutsia (Padj = 5,7 × 10⁻⁵) и Dorea (Padj = 0,03) и увеличением Anaerostipes (Padj = 0,01) в кишечнике (таблица S7H).
Хотя раннее воздействие биоразнообразия окружающей среды связывают с развитием хорошо функционирующей иммунной системы (1, 4), окончательное доказательство причинно-следственной связи все еще отсутствует. Данное исследование является первым интервенционным испытанием на людях, в котором биоразнообразие городской среды было изменено для изучения его влияния на комменсальный микробиом и иммунную систему у маленьких детей. 28-дневное вмешательство, включавшее обогащение биоразнообразия микробов на дворах детских садов, было связано с изменениями микробиоты кожи и кишечника детей, которые, в свою очередь, были связаны с изменениями уровней цитокинов в плазме и частоты Treg-клеток. Эти данные позволяют предположить, что воздействие микробного разнообразия окружающей среды может изменить микробиом и модулировать функцию иммунной системы у детей. В частности, вмешательство было связано со сдвигом в сторону более высокого соотношения между уровнями цитокинов IL-10 и IL-17A в плазме и положительной связью между разнообразием Gammaproteobacteria и частотой Treg-клеток в крови, что позволяет предположить, что вмешательство могло стимулировать иммунорегуляторные пути. Эти регуляторные изменения произошли, несмотря на несколько противоречивые данные по кожной микробиоте (см. рис. 1 и 2). В целом, исследование указывает на то, что модулировать иммунную систему возможно с помощью относительно простых действий, изменяющих среду обитания маленьких детей в городских сообществах.
Вмешательство поддерживало высокое разнообразие комменсальной кожной микробиоты, особенно среди Gammaproteobacteria, по сравнению с детьми в стандартных детских садах, у которых разнообразие этой микробиоты снизилось за период исследования. Наши результаты согласуются с предыдущими наблюдательными исследованиями, показывающими связи между маркерами иммунной системы, средой обитания и комменсальной микробиотой, включая кожные Gammaproteobacteria (1, 4, 12). Таким образом, результаты настоящего интервенционного исследования подтверждают гипотезу биоразнообразия (3, 4). Поскольку вмешательство, направленное на повышение биоразнообразия, предлагает непосредственный опыт общения с природой и обеспечивает мультисенсорное исследование и разнообразные обучающие ситуации (26), у детей, возможно, было больше прямых контактов с почвой и растительностью в детских садах с вмешательством, чем в стандартных детских садах. Время, проведенное во дворах, также может быть одним из объяснений того, почему разнообразие кожных Proteobacteria снизилось среди детей в стандартных детских садах, но не среди детей в детских садах с вмешательством, хотя время, проведенное на улице, было одинаковым во всех группах детских садов. Мы делаем вывод, что предоставление городским детям возможности играть в микробиологически разнообразной грязи и растительности изменяет микробиоту кожи и кишечника, что сопровождается параллельными изменениями в иммунной системе в течение относительно короткого периода в 1 месяц.
Важным аспектом этих выводов является то, что комменсальная микробиота детей в детских садах с вмешательством стала более похожей на ту, что наблюдается у детей, посещающих природоориентированные детские сады (рис. 1), где дети ежедневно совершают визиты в близлежащие леса. Сегодня подавляющее большинство детей в развитых обществах и все большее число в развивающихся живут в городских районах (28), и многие из них имеют ограниченный доступ к территориям, характеризующимся богатым природным биоразнообразием, таким как леса. Кроме того, зеленые зоны вокруг городской среды часто загрязнены вредителями и патогенными микробами (29). По этой причине можно ожидать, что предоставление детям возможности ежедневного контакта с разнообразной растительностью и землей в безопасных городских зеленых зонах, таких как игровые площадки и дворы детских садов или школ, может улучшить здоровье детей за счет активации регуляторных путей иммунной системы.
Это может снизить гиперактивные иммунные реакции и, следовательно, уменьшить риск развития иммуноопосредованных заболеваний. Кроме того, вмешательство, направленное на повышение биоразнообразия, может обеспечить преимущества для благополучия и увеличить физическую активность детей (26). Результаты настоящего исследования и нашего предыдущего исследования благополучия (26) поощряют внедрение этих решений в управление и планирование городской среды.
Воздействие микробного биоразнообразия повлияло на микробиоту кишечника, особенно на Ruminococcaceae (включая Faecalibacterium), которая включает грамотрицательные бактерии, связанные с поддержанием здоровья кишечника (30). Семейство также содержит установленные или потенциальные пробиотики (13). Вмешательство увеличило разнообразие Ruminococcaceae, хотя сами материалы вмешательства не содержали штаммов, обнаруженных в образцах стула. Это поднимает вопрос о том, был ли механизм иммунорегуляции в вмешательстве по повышению биоразнообразия принципиально иным по сравнению с воздействием пробиотических обработок; пробиотики улучшают численность только определенных штаммов и могут даже задерживать восстановление микробиоты кишечника после лечения антибиотиками (31). Пробиотические обработки также показали лишь ограниченный, если вообще какой-либо, эффект в профилактике аллергий (32). Более того, наш подход — вмешательство по повышению биоразнообразия — подвергал детей воздействию широкого спектра микробов окружающей среды, включая микроскопических беспозвоночных, простейших, грибы, архей и вирусы. Это воздействие также происходило через множественные пути, включая кожный и слизистые пути. Таким образом, такое вмешательство по повышению биоразнообразия должно активировать гораздо более широкий спектр рецепторов распознавания образов (PRR), чем пероральное лечение пробиотическими бактериями (33). Однако для выяснения природы потенциальной широкоспектральной стимуляции PRR с помощью описанного здесь подхода потребуются дальнейшие исследования.
Снижение разнообразия кожной микробиоты в стандартной группе детских садов без вмешательства также может быть объяснено снижением микробной активности в течение периода вмешательства. Поскольку вмешательство началось менее чем через месяц после таяния снега, и поскольку период вмешательства был сухим, верхний слой минеральной почвы, бетон и асфальт, вероятно, высыхали в течение вмешательства. Следовательно, неудивительно, что богатство Gammaproteobacteria и численность неидентифицированных OTU были выше в дворах с вмешательством, чем в стандартных дворах в конце периода вмешательства (см. рис. 1 и таблицу S3). Поскольку дети в группе вмешательства ежедневно контактировали с богатым сообществом Gammaproteobacteria поверхностного слоя почвы в будние дни, и поскольку Gammaproteobacteria располагаются ниже субэпидермальных отделов в коже (34), их содержание кожных Gammaproteobacteria, вероятно, оставалось выше по сравнению с детьми в стандартных детских садах. Было показано, что прикосновение к органическим материалам для ландшафтного дизайна немедленно увеличивает разнообразие Proteobacteria, включая Gammaproteobacteria, на коже (19). Параллельным фактором было увеличение желания играть с почвой и растительными материалами во дворах с вмешательством (26), что привело к увеличению добровольного микробного воздействия на детей.
Стандартные дворы детских садов, состоящие в основном из неорганических искусственных материалов для ландшафтного дизайна, можно рассматривать как искусственные суровые, засушливые среды. Поскольку засушливые среды обычно характеризуются низкой микробной активностью, но огромным микробным разнообразием, особенно при истощении питательных веществ (35), мы были удивлены, увидев более высокое богатство Proteobacteria во дворах с вмешательством. Возможно, что часть сообщества Proteobacteria во дворах с вмешательством произошла из периода до вмешательства и что перенос дерна и лесной подстилки привел к лаг-периоду, в течение которого бактериальное разнообразие и богатство все еще адаптировались к новой среде, поддерживающей рост. Мы рекомендуем отслеживать эффекты вмешательства по повышению биоразнообразия в течение более длительного периода, чтобы понять динамику микробного сообщества на дворах детских садов и увидеть долговечность изменений цитокинов в плазме.
Факторы, формирующие иммунный ответ, включают изменения во внешней среде и воздействие человеческих патогенов. Последнее вызывает провоспалительный ответ, например, влияет на соотношение IL-10:IL-17A (см. Таблицу 2). Поскольку различные домашние условия не маскировали различий между группами детских садов (см. рис. 1), влияние вмешательства по повышению биоразнообразия на комменсальную микробиоту было сильным по сравнению с потенциальными временными воздействиями в течение периода вмешательства. Поскольку богатство Gammaproteobacteria улучшилось, а неидентифицированные OTU в пределах Gammaproteobacteria были обогащены только во дворах с вмешательством, изменения кожных Gammaproteobacteria в стандартной и природоориентированной группах, вероятно, имели иное происхождение по сравнению с группой вмешательства. Это неудивительно, так как в стандартной группе Gammaproteobacteria поступали из городской незеленой среды, а дети в природоориентированных детских садах подвергались воздействию лесного биоразнообразия в течение всего года. Поэтому, и поскольку мы недавно продемонстрировали, как воздействие органической почвы снижает относительную численность родов, содержащих оппортунистические патогены, на коже городских жителей (36), положительные связи между разнообразием кожных Gammaproteobacteria и уровнями IL-17A в плазме в группах без вмешательства могут быть следствием воздействия гаммапротеобактериальных патогенов или других неидентифицированных факторов окружающей среды. В этом контексте примечательно, что групповые углы наклона регрессии между разнообразием кожных Gammaproteobacteria и многофункциональным цитокином TGF-β были схожи во всех группах детских садов и что численность неидентифицированного Faecalibacterium OTU 000008 в кишечнике была прямо связана с IL-17A в плазме во всех группах детских садов. Faecalibacterium prausnitzii, с другой стороны, была связана с IL-17A только в природоориентированной группе; мы недавно показали, что разнообразная растительность, которая является прокси для воздействия разнообразной микробиоты, связана с высокой численностью Faecalibacterium в кишечнике (17). Отсутствие связи F. prausnitzii–IL-17A в стандартных детских садах может быть результатом низкого ежедневного воздействия биоразнообразия окружающей среды, в то время как микрофлора кишечника у детей группы вмешательства, возможно, все еще адаптировалась к новой среде обитания с высоким биоразнообразием. В итоге, хотя связи между факторами окружающей среды и цитокинами сложны, настоящее исследование подчеркивает глубокое влияние вмешательства по повышению биоразнообразия на комменсальную микробиоту, что может частично объяснять расходящиеся связи между цитокинами плазмы и микробиотой в различных условиях детских садов.
Одним из основных недостатков нашего исследования была невозможность контролировать домашнюю среду. У семей разные условия жизни, образ жизни, и у детей разное количество братьев и сестер и домашних животных. Однако, хотя семьи с ребенком в природоориентированном детском саду могут часто интересоваться различными видами деятельности на свежем воздухе в своей личной жизни, это не было заметно во времени, проведенном на улице или в зеленых зонах. Вряд ли есть основания предполагать неизвестную систематическую ошибку между детскими садами с вмешательством и стандартными детскими садами при наборе. Вместо этого мы, очевидно, не можем исключить потенциальное влияние поведения ребенка вне детских садов. Эти неопределенности подчеркивают проблемы, присущие всем попыткам проведения интервенционных испытаний в обычной среде обитания среди семей с маленькими детьми, но они также подчеркивают важность среды детского сада с высоким биоразнообразием и результирующую силу связей между микробиотой кожи и кишечника и уровнями иммунных маркеров, несмотря на множество смешивающих факторов в городской среде обитания детей.
Во вмешательстве мы использовали медленно возобновляемую естественную лесную подстилку, запасы которой ограничены. Чтобы справиться с этой проблемой, мы недавно предложили широкоспектральный микробный инокулят из лесных и сельскохозяйственных материалов, который напоминает микробиоту в органических почвах и содержит широкий спектр эукариотических и прокариотических микроорганизмов, описанных выше, включая сотни неактивных и медленно растущих филотипов бактерий (19, 20). В недавнем исследовании (36) не было обнаружено факультативных патогенов и меньше оппортунистических патогенов на коже человека после контакта с песком игровой площадки, обогащенным широкоспектральным микробным инокулятом, по сравнению с контактом со стандартным песком игровой площадки или отсутствием контакта вообще. Двухнедельное испытание воздействия на людей (20) с этим широкоспектральным инокулятом не привело к каким-либо негативным последствиям для здоровья испытуемых. При условии, что предварительные результаты могут быть подтверждены в последующих интервенционных испытаниях, широкоспектральная стимуляция PRR вмешательством по повышению биоразнообразия может оказаться полезной для модуляции иммунной системы и микробных сообществ городских жителей (36).
Наше испытание имеет значение для интерпретации результатов предыдущих наблюдательных исследований (1–5, 12). Результаты этого исследования поддерживают гипотезу биоразнообразия и концепцию, согласно которой низкое биоразнообразие в современной среде обитания может привести к необученной иммунной системе и, следовательно, увеличить распространенность иммуноопосредованных заболеваний (4, 5). Аналогично, хотя в более ранних исследованиях сообщалось о снижении численности Faecalibacterium при нескольких иммунных нарушениях (13, 15), мы обнаружили, что высокая численность F. prausnitzii связана со сниженной экспрессией провоспалительного цитокина IL-17A среди здоровых детей. В заключение, наше исследование продемонстрировало, что изменение среды обитания детей с помощью микробиологически разнообразных природных материалов может предоставить осуществимый подход для снижения риска иммуноопосредованных заболеваний в городских популяциях.
Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Финского консультативного совета по научной добросовестности с одобрения этического комитета местного больничного округа (Пирканмаа, Финляндия). Письменное информированное согласие, полученное от всех опекунов, соответствовало Хельсинкской декларации.
В исследовании могли участвовать субъекты, посещающие детские сады и проживающие в городской среде и соответствующие критериям включения. В общей сложности в исследовании приняли участие 75 детей в возрасте от 3 до 5 лет. Критериями исключения из исследования были следующие: возраст младше 3 или старше 5 лет на начало исследования, неродная страна, отличная от Финляндии, иммунодефицит (например, дефицит антител и ВИЧ-инфекция), иммуносупрессивная терапия (например, кортикостероиды), состояние, влияющее на иммунный ответ (например, ревматоидный артрит, язвенный колит, болезнь Крона, диабет, синдром Дауна) или диагноз рака. Использование антибиотиков, пробиотиков, лекарств и другая справочная информация регистрировались с использованием стандартизированных анкет.
Чтобы изучить влияние вмешательства на комменсальную микробиоту и иммунорегуляцию, образцы кожи, стула и крови были собраны у детей до преобразования дворов и после периода вмешательства. Поверхностный слой почвы был собран до и после периода вмешательства со дворов детских садов, расположенных в Лахти. До вмешательства образцы были собраны из песочниц и игровых площадок, а после вмешательства также рядом с качелями и под спортивным комплексом.
Обученная медсестра-исследователь собирала образцы кожных мазков в детских садах, а родители детей собирали образцы стула дома. Кожные мазки брались с тыльной стороны руки (область 5 см × 5 см), 10-секундное протирание ватной палочкой, смоченной в солевом буфере (0,1% Tween 20 в 0,15 М NaCl). После отбора проб вата помещалась в стерильную полиэтиленовую пробирку и замораживалась при -80°C до использования для анализов микробиома. Образцы стула хранились в домашних морозильниках (-18° до 20°C) до тех пор, пока исследователи не собрали их и не хранили при -80°C.
Венозный образец крови брали из вены руки в пробирки Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation с цитратом натрия (BD Biosciences, Нью-Джерси, США) и центрифугировали согласно инструкциям производителя для отделения плазмы и мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). PBMC замораживали в замораживающей среде, состоящей из 10% диметилсульфоксида (Merck KGaA, Дармштадт, Германия), 10% человеческой сыворотки AB (Sigma-Aldrich, Миссури, США), пенициллина (50 Ед/мл) и стрептомицина (50 мкг/мл; Sigma-Aldrich, Миссури, США) и 10 мМ L-глутамина (Life Technologies, Калифорния, США) в среде RPMI 1640 (Life Technologies, Калифорния, США) с использованием контейнеров для замораживания при -80°C (BioCision LLC, Калифорния, США). Образцы PBMC переносили в жидкий азот для длительного хранения через 48 часов. Образцы плазмы хранили при -80°C.
Образцы кожи и стула для секвенирования MiSeq готовили, как в исследовании Roslund et al. (11). Почву, кожу и образцы стула секвенировали с помощью Illumina MiSeq 16S рибосомной РНК (рРНК) гена метабаркодирования с длиной считывания 2 × 300 пар оснований с использованием набора реагентов v3. Необработанные данные обрабатывали в Mothur (версия 1.39.5) (37), как описано Roslund et al. (10).
Бактериальные последовательности выравнивали по ссылке SILVA (версия 123) и классифицировали с использованием версии байесовского классификатора Mothur с набором для обучения RDP версии 16 с порогом начальной загрузки 80%. OTU с низкой численностью (≤10) и OTU, обнаруженные в отрицательных контролях экстракции и ПЦР, были удалены из данных последовательности. В экстракции ДНК кожи было обнаружено 3 OTU, в стуле — 0 OTU, а в почве — 21 OTU (3 совпадают с кожей) в контроле экстракции ДНК или ПЦР (стерильная вода). Наблюдаемое богатство OTU и разнообразие Шеннона рассчитывали в Mothur. Образцы почвы и стула были прорежены до глубины 3842, а образцы кожи — до глубины 329 для анализа состава бактериального сообщества. Для образцов кожи 13 из 28-дневных образцов не были собраны или количество последовательностей было слишком низким, и, таким образом, 29 детей из детских садов с вмешательством, 19 из природоориентированных детских садов и 13 из стандартных детских садов были включены в анализы образцов кожи. Индекс покрытия Гуда (среднее ± SD: почва, 0,96 ± 0,02; стул, 1,00 ± 0,00; кожа, 0,96 ± 0,06) использовали для определения адекватности покрытия OTU для анализа разнообразия и состава сообщества. Поскольку статистические тесты показали связи внутри рода Faecalibacterium, OTU Faecalibacterium были дополнительно идентифицированы с помощью микроорганизма BLASTN (версия 2.8.1+).
Концентрации IL-17A и IL-10 измеряли в образцах плазмы с использованием набора Milliplex MAP high-sensitivity T cell panel kit (Merck KGaA, Дармштадт, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Флуоресценцию анализировали с помощью системы Bio-Plex 200 (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США), и данные собирали с помощью программного обеспечения Bio-Plex Manager (версия 4.1, Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США). Концентрацию TGF-β1 анализировали с помощью иммуноферментного анализа (Bender MedSystems GmbH, Вена, Австрия).
Замороженные PBMC размораживали, и иммуноокрашивание для идентификации CD3+CD4+CD25+CD127lowFOXP3+ Treg-клеток проводили, как описано ранее (38). Частоту Treg-клеток определяли как процент от общего количества CD3+CD4+ Т-клеток.
Все статистические тесты проводились в R версии 3.4.2 (R Development Core Team, 2018) (39) с двусторонними тестами. Различия в составе сообщества анализировали с помощью PERMANOVA (функция adonis в пакете vegan) (40) с метрикой Брея-Кертиса. PERMANOVA анализировали с наборами данных о численности и наличии-отсутствии бактерий. PERMANOVA проводили на уровне OTU, рода, порядка, семейства, класса и типа, а также внутри некоторых конкретных таксонов, если относительная численность превышала 5% (образцы кожи и стула), и всякий раз, когда была причина предполагать биологическую значимость. В данных из образцов стула мы проанализировали различия в композиционных центроидах OTU Faecalibacterium, поскольку сравнительные исследования между пациентами с нарушениями иммунной системы и здоровыми людьми сообщали о сниженной численности Faecalibacterium в кишечнике пациентов (13, 15), и поскольку численность этого клада в наших данных превышала 5%. NMDS использовали с метрикой Брея-Кертиса для нанесения OTU Faecalibacterium на ординацию, и корреляцию с соответствующими уровнями экспрессии цитокинов оценивали с помощью функции envfit в пакете vegan в R. В образцах кожи мы проанализировали сообщества Gammaproteobacteria, поскольку они были связаны со средой обитания, экспрессией IL-10 и частотой атопии (4). В образцах стула и кожи мы также анализировали таксоны на уровне типа, класса, порядка или семейства, если численность превышала 5%. Поскольку численность и разнообразие бактерий, особенно в органических почвах, чрезвычайно высоки (21), для образцов почвы со дворов детских садов мы анализировали таксоны на уровне типа, класса, порядка, семейства и рода с помощью PERMANOVA, если численность превышала 1%.
Индекс разнообразия Шеннона использовали для оценки альфа-разнообразия, а многомерную однородность групповых дисперсий (PERMDISP) использовали для изучения бета-разнообразия. Различия в бактериальном богатстве (индекс Чао, прореженные виды и наблюдаемое богатство OTU), альфа-разнообразии и относительной численности бактерий между детьми детских садов определяли с помощью ANCOVA или, в случае ненормально распределенных данных, с помощью критерия Крускала-Уоллиса. Пол использовался в качестве ковариаты. Попарное сравнение проводилось с помощью теста Тьюки HSD или теста Данна. Связь между изменениями бактериального разнообразия и численности, а также уровнями экспрессии цитокинов и их изменениями оценивали с использованием LMM (функция lmer в пакете lme4). LMM строились для бактериальной таксономии с наблюдаемыми изменениями, т. е. изменениями относительной численности, разнообразия и богатства в ходе вмешательства. В LMM изменение экспрессии цитокинов или уровня Treg-клеток использовалось в качестве зависимой переменной, изменения бактерий — в качестве объясняющих переменных, а детский сад — в качестве случайной переменной.
Различия между временными точками определяли с помощью парного t-теста или, в случае ненормально распределенных данных, с помощью критерия знаковых рангов Уилкоксона. Чтобы концептуализировать частоту ложных открытий, все статистические тесты проводились с поправкой Беньямини-Хохберга (обозначается как Padj в результатах).
Первичной популяцией для анализа было намерение лечить (ITT). Популяция по протоколу (PP) (полные случаи) использовалась, когда анализировались изменения между двумя временными точками (исходный уровень и день 28). Кроме того, популяция PP для других анализов использовалась в качестве анализа чувствительности для исследования того, являются ли выводы чувствительными к предположениям относительно характера пропущенных данных. Эти анализы чувствительности проводились для значимых результатов, т. е. для ANCOVA кожи и цитокинов, а также для PERMANOVA Ruminococcaceae и Faecalibacterium.
Первичной мерой исхода для расчета мощности является разница между испытуемыми детских садов с вмешательством и стандартными контрольными детскими садами в изменении разнообразия Gammaproteobacteria на коже между исходным уровнем и днем 28. Мы использовали предварительные оценки эффекта из предыдущего исследования, которые оценивают корреляции между биоразнообразием окружающей среды, микробиотой человека и иммунной функцией (4).
Мы благодарим всех членов команды ADELE и AlmaLab за их поддержку. Особая благодарность семьям за их участие в этом исследовании. Мы также очень благодарны участвующим детским садам и их персоналу, а также городам Лахти и Тампере за возможность проведения исследования. Финансирование: Эта работа была поддержана Business Finland (ранее: Финское агентство финансирования инноваций TEKES) (номера грантов 40333/14, 6766/31/2017 и 7941/31/2017). Вклад авторов: A.S., H.H., O.H.L., R.P., M.I.R. и N.N. спроектировали исследование. R.P., M.G., M.I.R., H.K.V., A.S., N.N., N.S. и O.H.L. реализовали исследование. M.I.R., N.N., S.O., T.K., A.M.G., O.C. и L.K. генерировали данные. M.I.R., M.G., A.S. и A.P. анализировали данные. M.I.R., A.S., R.P., M.G., N.N., T.K., O.C., J.R., A.P., H.H. и O.H.L. написали рукопись. M.I.R, L.S. и A.S. подготовили рисунки и таблицы. A.S., H.H. и J.R. были главными исследователями проекта.
Конкурирующие интересы: A.S., H.H., O.H.L., M.G., N.N. и S.O. указаны в качестве изобретателей в заявке на патент «иммуномодулирующие составы», поданной Университетом Хельсинки (номер заявки на патент 20165932 в Финском патентно-регистрационном бюро).
M.G., A.P., M.I.R., A.S. и H.K.V. указаны в качестве изобретателей в заявке на патент «Иммуномодулирующий материал для садоводства и ландшафтного дизайна», поданной Университетом Хельсинки (номер заявки на патент 175196 в Финском патентно-регистрационном бюро). Ни один из изобретателей не получал гонораров от патентной заявки.
Доступность данных и материалов: Все данные бактериальных последовательностей были зарегистрированы в Sequence Read Archive (номер доступа PRJNA531814). Все другие данные, необходимые для поддержки выводов этой рукописи, включены в основной текст и дополнительные материалы.
M. M. Stein, C. L. Hrusch, J. Gozdz, C. Igartua, V. Pivniouk, S. E. Murray, J. G. Ledford, M. Marques dos Santos, R. L. Anderson, N. Metwali, J. W. Neilson, R. M. Maier, J. A. Gilbert, M. Holbreich, P. S. Thorne, F. D. Martinez, E. von Mutius, D. Vercelli, C. Ober, A. I. Sperling, Innate immunity and asthma risk in Amish and Hutterite farm children. N. Engl. J. Med. 375, 411–421 (2016).
A. Kondrashova, T. Seiskari, J. Ilonen, M. Knip, H. Hyöty, The «Hygiene hypothesis» and the sharp gradient in the incidence of autoimmune and allergic diseases between Russian Karelia and Finland. Apmis 121, 478–493 (2013).
T. Haahtela, A biodiversity hypothesis. Allergy Eur. J. Allergy Clin. Immunol., 1445–1456 (2019).
I. Hanski, L. von Hertzen, N. Fyhrquist, K. Koskinen, K. Torppa, T. Laatikainen, P. Karisola, P. Auvinen, L. Paulin, M. J. Makela, E. Vartiainen, T. U. Kosunen, H. Alenius, T. Haahtela, Environmental biodiversity, human microbiota, and allergy are interrelated. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.109, 8334–8339 (2012).
A. Parajuli, M. Grönroos, N. Siter, R. Puhakka, H. K. Vari, M. I. Roslund, A. Jumpponen, N. Nurminen, O. H. Laitinen, H. Hyöty, J. Rajaniemi, A. Sinkkonen, Urbanization reduces transfer of diverse environmental microbiota indoors. Front. Microbiol. 9, 84 (2018).
N. Hui, A. Parajuli, R. Puhakka, M. Grönroos, M. I. Roslund, H. K. Vari, V. A. O. Selonen, G. Yan, N. Siter, N. Nurminen, S. Oikarinen, O. H. Laitinen, J. Rajaniemi, H. Hyöty, A. Sinkkonen, Temporal variation in indoor transfer of dirt-associated environmental bacteria in agricultural and urban areas. Environ. Int. 132, 105069 (2019).
M. C. Noverr, G. B. Huffnagle, The «Microflora Hypothesis» of allergic disease. Adv. Exp. Med. Biol. 635, 113–134 (2008).
D. Graham-Rowe, Lifestyle: When allergies go west. Nature 479, S2–S4 (2011).
A. Parajuli, M. Grönroos, S. Kauppi, T. Płociniczak, M. I. Roslund, P. Galitskaya, O. H. Laitinen, H. Hyöty, A. Jumpponen, R. Strömmer, M. Romantschuk, N. Hui, A. Sinkkonen, The abundance of health-associated bacteria is altered in PAH polluted soils—Implications for health in urban areas? PLOS ONE 12, e0187852 (2017).
M. I. Roslund, M. Grönroos, A.-L. Rantalainen, A. Jumpponen, M. Romantschuk, A. Parajuli, H. Hyöty, O. Laitinen, A. Sinkkonen, Half-lives of PAHs and temporal microbiota changes in commonly used urban landscaping materials. PeerJ 6, e4508 (2018).
M. I. Roslund, S. Rantala, S. Oikarinen, R. Puhakka, N. Hui, A. Parajuli, O. H. Laitinen, H. Hyöty, A.-L. Rantalainen, A. Sinkkonen, M. Grönroos, N. Hui, R. Kalvo, N. Nurminen, S. Oikarinen, A. Parajuli, R. Puhakka, S. Rantala, M. I. Roslund, L. Soininen, G. Yan, O. H. Laitinen, J. Rajaniemi, H. Hyöty, A. Sinkkonen, Endocrine disruption and commensal bacteria alteration associated with gaseous and soil PAH contamination among daycare children. Environ. Int. 130, 104894 (2019).
L. Ruokolainen, L. Von Hertzen, N. Fyhrquist, T. Laatikainen, J. Lehtomäki, P. Auvinen, A. M. Karvonen, A. Hyvärinen, V. Tillmann, O. Niemelä, M. Knip, T. Haahtela, J. Pekkanen, I. Hanski, Green areas around homes reduce atopic sensitization in children. Allergy Eur. J. Allergy Clin. Immunol. 70, 195–202 (2015).
H. Sokol, B. Pigneur, L. Watterlot, O. Lakhdari, L. G. Bermúdez-Humarán, J.-J. Gratadoux, S. Blugeon, C. Bridonneau, J.-P. Furet, G. Corthier, C. Grangette, N. Vasquez, P. Pochart, G. Trugnan, G. Thomas, H. M. Blottière, J. Doré, P. Marteau, P. Seksik, P. Langella, Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16731–16736 (2008).
L. Flandroy, T. Poutahidis, G. Berg, G. Clarke, M. C. Dao, E. Decaestecker, E. Furman, T. Haahtela, S. Massart, H. Plovier, Y. Sanz, G. Rook, The impact of human activities and lifestyles on the interlinked microbiota and health of humans and of ecosystems. Sci. Total Environ. 627, 1018–1038 (2018).
J. Stokholm, M. J. Blaser, J. Thorsen, M. A. Rasmussen, J. Waage, R. K. Vinding, A. M. M. Schoos, A. Kunøe, N. R. Fink, B. L. Chawes, K. Bønnelykke, A. D. Brejnrod, M. S. Mortensen, W. A. Al-Soud, S. J. Sørensen, H. Bisgaard, Maturation of the gut microbiome and risk of asthma in childhood. Nat. Commun. 9, 141 (2018).
C. Huttenhower, D. Gevers, R. Knight, S. Abubucker, J. H. Badger, A. T. Chinwalla, H. H. Creasy, A. M. Earl, M. G. Fitzgerald, R. S. Fulton, M. G. Giglio, K. Hallsworth-Pepin, E. A. Lobos, R. Madupu, V. Magrini, J. C. Martin, M. Mitreva, D. M. Muzny, E. J. Sodergren, J. Versalovic, A. M. Wollam, K. C. Worley, J. R. Wortman, S. K. Young, Q. Zeng, K. M. Aagaard, O. O. Abolude, E. Allen-Vercoe, E. J. Alm, L. Alvarado, G. L. Andersen, S. Anderson, E. Appelbaum, H. M. Arachchi, G. Armitage, C. A. Arze, T. Ayvaz, C. C. Baker, L. Begg, T. Belachew, V. Bhonagiri, M. Bihan, M. J. Blaser, T. Bloom, V. Bonazzi, J. P. Brooks, G. A. Buck, C. J. Buhay, D. A. Busam, J. L. Campbell, S. R. Canon, B. L. Cantarel, P. S. G. Chain, I. M. A. Chen, L. Chen, S. Chhibba, K. Chu, D. M. Ciulla, J. C. Clemente, S. W. Clifton, S. Conlan, J. Crabtree, M. A. Cutting, N. J. Davidovics, C. C. Davis, T. Z. Desantis, C. Deal, K. D. Delehaunty, F. E. Dewhirst, E. Deych, Y. Ding, D. J. Dooling, S. P. Dugan, W. M. Dunne, A. Scott Durkin, R. C. Edgar, R. L. Erlich, C. N. Farmer, R. M. Farrell, K. Faust, M. Feldgarden, V. M. Felix, S. Fisher, A. A. Fodor, L. J. Forney, L. Foster, V. Di Francesco, J. Friedman, D. C. Friedrich, C. C. Fronick, L. L. Fulton, H. Gao, N. Garcia, G. Giannoukos, C. Giblin, M. Y. Giovanni, J. M. Goldberg, J. Goll, A. Gonzalez, A. Griggs, S. Gujja, S. Kinder Haake, B. J. Haas, H. A. Hamilton, E. L. Harris, T. A. Hepburn, B. Herter, D. E. Hoffmann, M. E. Holder, C. Howarth, K. H. Huang, S. M. Huse, J. Izard, J. K. Jansson, H. Jiang, C. Jordan, V. Joshi, J. A. Katancik, W. A. Keitel, S. T. Kelley, C. Kells, N. B. King, D. Knights, H. H. Kong, O. Koren, S. Koren, K. C. Kota, C. L. Kovar, N. C. Kyrpides, P. S. La Rosa, S. L. Lee, K. P. Lemon, N. Lennon, C. M. Lewis, L. Lewis, R. E. Ley, K. Li, K. Liolios, B. Liu, Y. Liu, C. C. Lo, C. A. Lozupone, R. D. Lunsford, T. Madden, A. A. Mahurkar, P. J. Mannon, E. R. Mardis, V. M. Markowitz, K. Mavromatis, J. M. McCorrison, D. McDonald, J. McEwen, A. L. McGuire, P. McInnes, T. Mehta, K. A. Mihindukulasuriya, J. R. Miller, P. J. Minx, I. Newsham, C. Nusbaum, M. Oglaughlin, J. Orvis, I. Pagani, K. Palaniappan, S. M. Patel, M. Pearson, J. Peterson, M. Podar, C. Pohl, K. S. Pollard, M. Pop, M. E. Priest, L. M. Proctor, X. Qin, J. Raes, J. Ravel, J. G. Reid, M. Rho, R. Rhodes, K. P. Riehle, M. C. Rivera, B. Rodriguez-Mueller, Y. H. Rogers, M. C. Ross, C. Russ, R. K. Sanka, P. Sankar, J. F. Sathirapongsasuti, J. A. Schloss, P. D. Schloss, T. M. Schmidt, M. Scholz, L. Schriml, A. M. Schubert, N. Segata, J. A. Segre, W. D. Shannon, R. R. Sharp, T. J. Sharpton, N. Shenoy, N. U. Sheth, G. A. Simone, I. Singh, C. S. Smillie, J. D. Sobel, D. D. Sommer, P. Spicer, G. G. Sutton, S. M. Sykes, D. G. Tabbaa, M. Thiagarajan, C. M. Tomlinson, M. Torralba, T. J. Treangen, R. M. Truty, T. A. Vishnivetskaya, J. Walker, L. Wang, Z. Wang, D. V. Ward, W. Warren, M. A. Watson, C. Wellington, K. A. Wetterstrand, J. R. White, K. Wilczek-Boney, Y. Wu, K. M. Wylie, T. Wylie, C. Yandava, L. Ye, Y. Ye, S. Yooseph, B. P. Youmans, L. Zhang, Y. Zhou, Y. Zhu, L. Zoloth, J. D. Zucker, B. W. Birren, R. A. Gibbs, S. K. Highlander, B. A. Methé, K. E. Nelson, J. F. Petrosino, G. M. Weinstock, R. K. Wilson, O. White, Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature 486, 207–214 (2012).
A. Parajuli, N. Hui, R. Puhakka, S. Oikarinen, M. Grönroos, V. A. O. Selonen, N. Siter, L. Kramna, M. I. Roslund, H. K. Vari, N. Nurminen, H. Honkanen, J. Hintikka, H. Sarkkinen, M. Romantschuk, M. Kauppi, R. Valve, O. Činek, O. H. Laitinen, J. Rajaniemi, H. Hyöty, A. Sinkkonen, Yard vegetation is associated with gut microbiota composition. Sci. Total Environ. 713, 136707 (2020).
J. Lehtimäki, A. Karkman, T. Laatikainen, L. Paalanen, L. Von Hertzen, T. Haahtela, I. Hanski, L. Ruokolainen, Patterns in the skin microbiota differ in children and teenagers between rural and urban environments. Sci. Rep. 7, 1–11 (2017).
M. Grönroos, A. Parajuli, O. H. Laitinen, M. I. Roslund, H. K. Vari, H. Hyöty, R. Puhakka, A. Sinkkonen, Short-term direct contact with soil and plant materials leads to an immediate increase in diversity of skin microbiota. Microbiology 8, e00645 (2019).
N. Nurminen, J. Lin, M. Grönroos, R. Puhakka, L. Kramna, H. K. Vari, H. Viskari, S. Oikarinen, M. Roslund, A. Parajuli, I. Tyni, O. Cinek, O. Laitinen, H. Hyöty, A. Sinkkonen, Nature-derived microbiota exposure as a novel immunomodulatory approach. Future Microbiol. 13, 737–744 (2018).
L. Thompson, J. G. Sanders, D. M. Donald, A. Amir, J. Ladau, K. J. Locey, R. J. Prill, A. Tripathi, S. M. Gibbons, G. Ackermann, J. A. Navas-Molina, S. Janssen, E. Kopylova, Y. Vázquez-Baeza, A. González, J. T. Morton, S. Mirarab, Z. Z. Xu, L. Jiang, M. F. Haroon, J. Kanbar, Q. Zhu, S. J. Song, T. Kosciolek, N. A. Bokulich, J. Lefler, C. J. Brislawn, G. Humphrey, S. M. Owens, J. Hampton-Marcell, D. Berg-Lyons, V. M. Kenzie, N. Fierer, J. A. Fuhrman, A. Clauset, R. L. Stevens, A. Shade, K. S. Pollard, K. D. Goodwin, J. K. Jansson, J. A. Gilbert, R. Knight; The Earth Microbiome Project Consortium, A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity. Nature 551, 457–463 (2017).
S. M. Opal, V. A. DePalo, Anti-inflammatory cytokines. Chest 117, 1162–1172 (2000).
M. M. Stein, C. L. Hrusch, J. Gozdz, C. Igartua, V. Pivniouk, S. E. Murray, J. G. Ledford, M. Marques dos Santos, R. L. Anderson, N. Metwali, J. W. Neilson, R. M. Maier, J. A. Gilbert, M. Holbreich, P. S. Thorne, F. D. Martinez, E. von Mutius, D. Vercelli, C. Ober, A. I. Sperling, Innate immunity and asthma risk in Amish and Hutterite farm children. N. Engl. J. Med. 375, 411–421 (2016).
A. Kondrashova, T. Seiskari, J. Ilonen, M. Knip, H. Hyöty, The «Hygiene hypothesis» and the sharp gradient in the incidence of autoimmune and allergic diseases between Russian Karelia and Finland. Apmis 121, 478–493 (2013).
T. Haahtela, A biodiversity hypothesis. Allergy Eur. J. Allergy Clin. Immunol., 1445–1456 (2019).
I. Hanski, L. von Hertzen, N. Fyhrquist, K. Koskinen, K. Torppa, T. Laatikainen, P. Karisola, P. Auvinen, L. Paulin, M. J. Makela, E. Vartiainen, T. U. Kosunen, H. Alenius, T. Haahtela, Environmental biodiversity, human microbiota, and allergy are interrelated. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.109, 8334–8339 (2012).
A. Parajuli, M. Grönroos, N. Siter, R. Puhakka, H. K. Vari, M. I. Roslund, A. Jumpponen, N. Nurminen, O. H. Laitinen, H. Hyöty, J. Rajaniemi, A. Sinkkonen, Urbanization reduces transfer of diverse environmental microbiota indoors. Front. Microbiol. 9, 84 (2018).
N. Hui, A. Parajuli, R. Puhakka, M. Grönroos, M. I. Roslund, H. K. Vari, V. A. O. Selonen, G. Yan, N. Siter, N. Nurminen, S. Oikarinen, O. H. Laitinen, J. Rajaniemi, H. Hyöty, A. Sinkkonen, Temporal variation in indoor transfer of dirt-associated environmental bacteria in agricultural and urban areas. Environ. Int. 132, 105069 (2019).
M. C. Noverr, G. B. Huffnagle, The «Microflora Hypothesis» of allergic disease. Adv. Exp. Med. Biol. 635, 113–134 (2008).
D. Graham-Rowe, Lifestyle: When allergies go west. Nature 479, S2–S4 (2011).
A. Parajuli, M. Grönroos, S. Kauppi, T. Płociniczak, M. I. Roslund, P. Galitskaya, O. H. Laitinen, H. Hyöty, A. Jumpponen, R. Strömmer, M. Romantschuk, N. Hui, A. Sinkkonen, The abundance of health-associated bacteria is altered in PAH polluted soils—Implications for health in urban areas? PLOS ONE 12, e0187852 (2017).
M. I. Roslund, M. Grönroos, A.-L. Rantalainen, A. Jumpponen, M. Romantschuk, A. Parajuli, H. Hyöty, O. Laitinen, A. Sinkkonen, Half-lives of PAHs and temporal microbiota changes in commonly used urban landscaping materials. PeerJ 6, e4508 (2018).
M. I. Roslund, S. Rantala, S. Oikarinen, R. Puhakka, N. Hui, A. Parajuli, O. H. Laitinen, H. Hyöty, A.-L. Rantalainen, A. Sinkkonen, M. Grönroos, N. Hui, R. Kalvo, N. Nurminen, S. Oikarinen, A. Parajuli, R. Puhakka, S. Rantala, M. I. Roslund, L. Soininen, G. Yan, O. H. Laitinen, J. Rajaniemi, H. Hyöty, A. Sinkkonen, Endocrine disruption and commensal bacteria alteration associated with gaseous and soil PAH contamination among daycare children. Environ. Int. 130, 104894 (2019).
L. Ruokolainen, L. Von Hertzen, N. Fyhrquist, T. Laatikainen, J. Lehtomäki, P. Auvinen, A. M. Karvonen, A. Hyvärinen, V. Tillmann, O. Niemelä, M. Knip, T. Haahtela, J. Pekkanen, I. Hanski, Green areas around homes reduce atopic sensitization in children. Allergy Eur. J. Allergy Clin. Immunol. 70, 195–202 (2015).
J. Lehtimäki, A. Karkman, T. Laatikainen, L. Paalanen, L. Von Hertzen, T. Haahtela, I. Hanski, L. Ruokolainen, Patterns in the skin microbiota differ in children and teenagers between rural and urban environments. Sci. Rep. 7, 1–11 (2017).
M. Grönroos, A. Parajuli, O. H. Laitinen, M. I. Roslund, H. K. Vari, H. Hyöty, R. Puhakka, A. Sinkkonen, Short-term direct contact with soil and plant materials leads to an immediate increase in diversity of skin microbiota. Microbiology 8, e00645 (2019).
N. Nurminen, J. Lin, M. Grönroos, R. Puhakka, L. Kramna, H. K. Vari, H. Viskari, S. Oikarinen, M. Roslund, A. Parajuli, I. Tyni, O. Cinek, O. Laitinen, H. Hyöty, A. Sinkkonen, Nature-derived microbiota exposure as a novel immunomodulatory approach. Future Microbiol. 13, 737–744 (2018).
L. Thompson, J. G. Sanders, D. M. Donald, A. Amir, J. Ladau, K. J. Locey, R. J. Prill, A. Tripathi, S. M. Gibbons, G. Ackermann, J. A. Navas-Molina, S. Janssen, E. Kopylova, Y. Vázquez-Baeza, A. González, J. T. Morton, S. Mirarab, Z. Z. Xu, L. Jiang, M. F. Haroon, J. Kanbar, Q. Zhu, S. J. Song, T. Kosciolek, N. A. Bokulich, J. Lefler, C. J. Brislawn, G. Humphrey, S. M. Owens, J. Hampton-Marcell, D. Berg-Lyons, V. M. Kenzie, N. Fierer, J. A. Fuhrman, A. Clauset, R. L. Stevens, A. Shade, K. S. Pollard, K. D. Goodwin, J. K. Jansson, J. A. Gilbert, R. Knight; The Earth Microbiome Project Consortium, A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity. Nature 551, 457–463 (2017).
S. M. Opal, V. A. DePalo, Anti-inflammatory cytokines. Chest 117, 1162–1172 (2000).
J. Honkanen, J. K. Nieminen, R. Gao, K. Luopajarvi, H. M. Salo, J. Ilonen, M. Knip, T. Otonkoski, O. Vaarala, IL-17 immunity in human type 1 diabetes. J. Immunol. 185, 1959–1967 (2010).
W. Jin, C. Dong, IL-17 cytokines in immunity and inflammation. Emerg. Microbes Infect. 2, e60 (2013).
D. A. A. Vignali, L. W. Collison, C. J. Workman, How regulatory T cells work. Nat. Rev. Immunol. 8, 523–532 (2008).
R. Puhakka, O. Rantala, M. I. Roslund, J. Rajaniemi, O. H. Laitinen, A. Sinkkonen, Greening of daycare yards with biodiverse materials affords well-being, play and environmental relationships. IJERPH 16, 1–16 (2019).
J. Walsh, B. T. Griffin, G. Clarke, N. P. Hyland, Drug–gut microbiota interactions: Implications for neuropharmacology. Br. J. Pharmacol. 175, 4415–4429 (2018).
United Nations, World Urbanization Prospects: The 2018 Revision (UNDESA, 2018).
P. Heyman, C. Cochez, A. Hofhuis, J. Van Der Giessen, H. Sprong, S. R. Porter, B. Losson, C. Saegerman, O. Donoso-Mantke, M. Niedrig, A. Papa, A clear and present danger: Tick-borne diseases in Europe. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 8, 33–50 (2010).
C. E. West, P. Rydén, D. Lundin, L. Engstrand, M. K. Tulic, S. L. Prescott, Gut microbiome and innate immune response patterns in IgE-associated eczema. Clin. Exp. Allergy 45, 1419–1429 (2015).
J. Suez, N. Zmora, G. Zilberman-schapira, Z. Halpern, E. Segal, E. Elinav, Post-antibiotic gut mucosal microbiome reconstitution is impaired by probiotics and improved by autologous FMT. Cell 174, 1406–1423.e16 (2018).
M. Mennini, L. Dahdah, M. C. Artesani, A. Fiocchi, A. Martelli, Probiotics in asthma and allergy prevention. Front. Pediatr. 5, 165 (2017).
T. Kawai, S. Akira, The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: Update on Toll-like receptors. Nat. Immunol. 11, 373–384 (2010).
T. Nakatsuji, H. Chiang, S. B. Jiang, H. Nagarajan, K. Zengler, R. L. Gallo, The microbiome extends to subepidermal compartments of normal skin. Nat. Commun. 4, 1431 (2013).
S. An, C. Couteau, F. Luo, J. Neveu, M. S. DuBow, Bacterial diversity of surface sand samples from the gobi and taklamaken deserts. Microb. Ecol. 66, 850–860 (2013).
N. Hui, M. Grönroos, M. I. Roslund, A. Parajuli, H. K. Vari, L. Soininen, O. H. Laitinen, A. Sinkkonen; The ADELE Research Group, Diverse environmental microbiota as a tool to augment biodiversity in urban landscaping materials. Front. Microbiol. 10, 536 (2019).
P. D. Schloss, S. L. Westcott, T. Ryabin, J. R. Hall, M. Hartmann, E. B. Hollister, R. A. Lesniewski, B. B. Oakley, D. H. Parks, C. J. Robinson, J. W. Sahl, B. Stres, G. G. Thallinger, D. J. Van Horn, C. F. Weber, Introducing mothur: Open-Source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 75, 7537–7541 (2009).
T. Viisanen, A. M. Gazali, E. L. Ihantola, I. Ekman, K. Näntö-Salonen, R. Veijola, J. Toppari, M. Knip, J. Ilonen, T. Kinnunen, FOXP3+ regulatory T cell compartment is altered in children with newly diagnosed type 1 diabetes but not in autoantibody-positive at-risk children. Front. Immunol. 10, 19 (2019).
R Core Development Team, R: A Language and Environment for Statistical Computing (R Foundation for Statistical Computing, 2018);
J. Oksanen, F. G. Blanchet, R. Kindt, P. Legendre, P. R. Minchin, R. B. O’Hara, G. L. Simpson, P. Solymos, M. H. M. Stevens, H. Wagner, Package «vegan»: Community ecology package (2019);
J. Honkanen, J. K. Nieminen, R. Gao, K. Luopajarvi, H. M. Salo, J. Ilonen, M. Knip, T. Otonkoski, O. Vaarala, IL-17 immunity in human type 1 diabetes. J. Immunol. 185, 1959–1967 (2010).
W. Jin, C. Dong, IL-17 cytokines in immunity and inflammation. Emerg. Microbes Infect. 2, e60 (2013).
D. A. A. Vignali, L. W. Collison, C. J. Workman, How regulatory T cells work. Nat. Rev. Immunol. 8, 523–532 (2008).
R. Puhakka, O. Rantala, M. I. Roslund, J. Rajaniemi, O. H. Laitinen, A. Sinkkonen, Greening of daycare yards with biodiverse materials affords well-being, play and environmental relationships. IJERPH 16, 1–16 (2019).
J. Walsh, B. T. Griffin, G. Clarke, N. P. Hyland, Drug–gut microbiota interactions: Implications for neuropharmacology. Br. J. Pharmacol. 175, 4415–4429 (2018).
United Nations, World Urbanization Prospects: The 2018 Revision (UNDESA, 2018).
P. Heyman, C. Cochez, A. Hofhuis, J. Van Der Giessen, H. Sprong, S. R. Porter, B. Losson, C. Saegerman, O. Donoso-Mantke, M. Niedrig, A. Papa, A clear and present danger: Tick-borne diseases in Europe. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 8, 33–50 (2010).
C. E. West, P. Rydén, D. Lundin, L. Engstrand, M. K. Tulic, S. L. Prescott, Gut microbiome and innate immune response patterns in IgE-associated eczema. Clin. Exp. Allergy 45, 1419–1429 (2015).
J. Suez, N. Zmora, G. Zilberman-schapira, Z. Halpern, E. Segal, E. Elinav, Post-antibiotic gut mucosal microbiome reconstitution is impaired by probiotics and improved by autologous FMT. Cell 174, 1406–1423.e16 (2018).
M. Mennini, L. Dahdah, M. C. Artesani, A. Fiocchi, A. Martelli, Probiotics in asthma and allergy prevention. Front. Pediatr. 5, 165 (2017).
T. Kawai, S. Akira, The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: Update on Toll-like receptors. Nat. Immunol. 11, 373–384 (2010).
T. Nakatsuji, H. Chiang, S. B. Jiang, H. Nagarajan, K. Zengler, R. L. Gallo, The microbiome extends to subepidermal compartments of normal skin. Nat. Commun. 4, 1431 (2013).
S. An, C. Couteau, F. Luo, J. Neveu, M. S. DuBow, Bacterial diversity of surface sand samples from the gobi and taklamaken deserts. Microb. Ecol. 66, 850–860 (2013).
N. Hui, M. Grönroos, M. I. Roslund, A. Parajuli, H. K. Vari, L. Soininen, O. H. Laitinen, A. Sinkkonen; The ADELE Research Group, Diverse environmental microbiota as a tool to augment biodiversity in urban landscaping materials. Front. Microbiol. 10, 536 (2019).
P. D. Schloss, S. L. Westcott, T. Ryabin, J. R. Hall, M. Hartmann, E. B. Hollister, R. A. Lesniewski, B. B. Oakley, D. H. Parks, C. J. Robinson, J. W. Sahl, B. Stres, G. G. Thallinger, D. J. Van Horn, C. F. Weber, Introducing mothur: Open-Source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 75, 7537–7541 (2009).
T. Viisanen, A. M. Gazali, E. L. Ihantola, I. Ekman, K. Näntö-Salonen, R. Veijola, J. Toppari, M. Knip, J. Ilonen, T. Kinnunen, FOXP3+ regulatory T cell compartment is altered in children with newly diagnosed type 1 diabetes but not in autoantibody-positive at-risk children. Front. Immunol. 10, 19 (2019).
R Core Development Team, R: A Language and Environment for Statistical Computing (R Foundation for Statistical Computing, 2018);
J. Oksanen, F. G. Blanchet, R. Kindt, P. Legendre, P. R. Minchin, R. B. O’Hara, G. L. Simpson, P. Solymos, M. H. M. Stevens, H. Wagner, Package «vegan»: Community ecology package (2019); http://vegan.r-forge.r-project.org/.